色譜柱范文

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篇1

關(guān)鍵詞 離子色譜法；色譜柱；性能比較

中圖分類號O657 文獻標(biāo)識碼A 文章編號 1674-6708（2013）102-0126-02

0 引言

離子色譜是高效液相色譜的一種，主要用于陰離子、陽離子的分析。對難以用其他儀器和方法分析的常見陰離子、陽離子、有機酸和有機胺類等組分的分析，離子色譜法也具有選擇性好，靈敏、快速、簡便，同時測定多組分的優(yōu)點。

離子色譜的最重要的部件是分離柱。柱管材料應(yīng)是惰性的，一般均在室溫下使用。分離柱的填料由基質(zhì)和功能基兩部分組成。作為填料的基質(zhì)可分為有機聚合物基質(zhì)和無機（硅膠、氧化鋁）基質(zhì)兩大類。其中有機聚合物離子交換樹脂應(yīng)用較廣，是目前商品化分離柱的主要填料。高性能分離柱的有效性，是離子色譜發(fā)展的關(guān)鍵。

本實驗是針對國產(chǎn)的陰離子柱對于常見七種陰離子的分離效能與美國戴安公司的陰離子柱的柱效進行比較，藉以了解國內(nèi)與國外離子色譜技術(shù)的水平。

1試驗部分

1.1儀器和試劑

1.2溶液和淋洗液的配置

1.2.1濃度為1000ppm儲備液的配置

1.2.2濃度為10ppm單標(biāo)的配置

1.2.3混標(biāo)的配置

1.2.4淋洗液的配置

1.3色譜條件

2 結(jié)果與建議

2.2 結(jié)果

從圖1與圖2中能看出國產(chǎn)SH-AC-1樣品的保留時間要大于戴安色譜柱。SH-AC-1需要22min才能完全出峰，戴安的15min能完全出峰。從表1與表2中能看出國產(chǎn)色譜柱對各峰的保留時間長和理論塔板數(shù)偏低。國產(chǎn)SH-AC-1色譜柱F離子和水負峰分離不開，H2PO4與Br分離度小于1.5，戴安的色譜柱的柱效要比國產(chǎn)色譜柱的柱效要好。

2.3 建議

1）與國外的色譜柱的柱填料相比國產(chǎn)柱的柱填料應(yīng)做哪些改進；

2）與國外的色譜柱的柱內(nèi)徑相比國產(chǎn)柱的柱內(nèi)徑能更小為好；

3）若國產(chǎn)柱的柱壓與總電導(dǎo)與戴安的離子柱一樣，這樣對F離子與水負峰的分離與H2PO4與Br分離度是否會更好，柱效會有所提高。

參考文獻

[1]ISO/IEC17025-1999.General Requirement for the Competence of Galibration and Testing Laboratories [S].

篇2

[關(guān)鍵詞] 牛血清白蛋白；生物色譜柱；阿司匹林

[中圖分類號] R96[文獻標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04

Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin

TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1

1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China

[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.

[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin

牛血清白蛋白色譜柱的制備

及對阿司匹林的

1.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧 530021

[摘要] 目的 制備生物色譜柱，用于分離或測定藥物成分。 方法 采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）與硅膠反應(yīng)生成氨基功能化的活化硅膠，并與牛血清蛋白（BSA）共價結(jié)合形成BSA鍵合固定相，勻漿裝柱制備成BSA生物色譜柱，以阿司匹林（Aspirin，ASP）為分析對象考察BSA固定相的結(jié)合性能和分離性能。 結(jié)果 BSA結(jié)合率為3.69 μmol/g，ASP在BSA鍵合固定相色譜柱上的最大結(jié)合量為74 mg/g，經(jīng)BSA色譜柱測得阿司匹林腸溶片的含量為14.65 μg/片，標(biāo)示量為107.8%。 結(jié)論 這表明BSA與硅膠載體成功結(jié)合形成BSA鍵合固定相，所制備的BSA生物色譜柱具有良好的結(jié)合性能與分離性能。

[關(guān)鍵詞] 牛血清白蛋白；生物色譜柱；阿司匹林

[中圖分類號] R96[文獻標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04

Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin

TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1

1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China

[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.

[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin分子生物色譜法（MBC）是20世紀(jì)80年代中后期逐漸發(fā)展起來的以酶、受體、抗體、傳輸?shù)鞍椎壬锎蠓肿訛楣潭ㄏ嗟囊活惿V法，是基于生物大分子的特異性相互作用原理進行分離純化具有活性的化合物或測定生化參數(shù)的一項新興技術(shù)[1]。藥物作為一類重要的生物活性物質(zhì)與血漿蛋白存在可逆性的結(jié)合平衡，藥物分子通過血漿白蛋白的運輸?shù)竭_受體部位發(fā)生藥理作用，而藥物分子在體內(nèi)與血漿蛋白的相互作用是其發(fā)揮藥理作用的前提，因此可以通過血漿白蛋白生物色譜篩選藥物中的活性成分。付強等[2]通過自制人血清白蛋白色譜柱成功對DL（±）色氨酸進行了手性分離；Bentucci等[3]制備出的血清白蛋白色譜柱，不僅可篩選出藥物活性成分，還可通過體外實驗反映藥物-血清白蛋白的相互作用。蔡漢寧等[4]制備出核心組蛋白色譜柱作用于其活性物質(zhì)，至少篩選出9種組蛋白作用蛋白。與傳統(tǒng)的實驗方法相比，分子生物色譜法具有高度專一性、分離速度更快、容易自動化操作、重復(fù)性好等優(yōu)點[5]。

由于人血清白蛋白價格昂貴，用于制備生物色譜柱成本太高，有學(xué)者利用牛血清白蛋白與人血清白蛋白結(jié)構(gòu)相似的特點，制備成牛血清白蛋白色譜柱用于中藥活性成分的分離測定。Tan等[6]通過制備的牛血清蛋白生物整體柱，成功的分離出當(dāng)歸的活性成分，并考察了當(dāng)歸提取液在該整體柱上保留的影響。本文主要通過將硅膠氨基功能化與BSA共價鍵結(jié)合合成BSA固定相，制備BSA生物色譜柱，并選擇了阿司匹林（ASP）作為與BSA結(jié)合的對象來驗證BSA色譜柱的性能。ASP作為一種代表性藥物，不僅具有卓越的消炎、退熱、止痛能力，研究表明它還可以協(xié)同干擾素抑制肝細胞癌生長轉(zhuǎn)移[7]，抑制宮頸癌Hela細胞增殖[8]，預(yù)防妊娠期高血壓[9]等。通過對ASP及其腸溶片的分離測定，可以進一步探討生物色譜柱在藥物有效成分分離測定中的應(yīng)用前景。

1 儀器與材料

6010紫外可見分光度計（安捷倫科技公司，上海）；LC-10Tvp高效液相色譜儀（日本島津公司）；spectrum 100傅立葉變換紅外光譜儀（美國penkim Elmer儀器有限公司）；Bio-Rad垂直電泳槽、電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）（97%，上海晶純試劑有限公司，批號：15122）；N，N′-琥珀酰亞胺碳酸酯（98%，阿拉丁公司，批號：25231）；考馬斯亮藍G250（沃凱，批號：WB20091102）；BSA（Solarbio）；硅膠Sepra Silica （粒徑50 μm，phenomenex 美國）；ASP標(biāo)準(zhǔn)品（Purity>99%）；ASP腸溶片（50 mg/片，國藥準(zhǔn)字H43021814）；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺溶液、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺、Tris堿、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）均來自北京索萊寶。

2 方法與結(jié)果

2.1 BSA色譜柱的制備

取硅膠2 g（平均粒徑為50 μm，孔徑46 Å（1 Å=0.1 nm），比表面積為518 m2/g），加入適量甲苯回流除去殘留水分，按10 μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反應(yīng)8 h得到氨丙基硅膠，過濾，分別用甲苯和甲醇洗滌，真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅膠2 g，加入乙腈5 mL和N，N′-琥珀酰亞胺碳酸酯2 g，于30℃反應(yīng)24 h，過濾后分別用乙腈、甲醇洗滌得到活化硅膠。取制備得的活性硅膠1.5 g，加入到25 mmol/L（pH=6.6）的磷酸鹽緩沖液中，再加入適量BSA，30℃下攪拌反應(yīng)20 h，過濾后依次用水及5%乙醇多次洗滌，得到BSA固定相。將制備好的BSA固定相用緩沖液勻漿后注入不銹鋼柱（4.5 nm×150 nm）中，并抽真空壓緊柱，制備得到BSA色譜柱。

2.2 傅里葉紅外光譜（FTIR）驗證活化硅膠功能基團

用溴化鉀壓片法制備活化硅膠樣品，進行FTIR分析。FTIR分析結(jié)果見圖1，硅膠（a）和活化硅膠（b）共有的吸收峰有：1099、1103 cm-1處的非對稱伸縮振動，指紋區(qū)800 cm-1的對稱伸縮振動和470 cm-1的彎曲振動，均為硅膠的主要結(jié)構(gòu)Si-O的特征譜帶；與硅膠（a）相比，活化硅膠（b）增加了伯胺（-NH2）的吸收峰1402、1561 cm-1，2928 cm-1峰為亞甲基的不對稱變形振動峰，說明硅膠上中有亞甲基的存在，表明APTS已結(jié)合在硅膠上。由此可見，活化硅膠成功連接上了氨基功能基團。

a.硅膠；b.活化硅膠

圖1 硅膠和活化硅膠的紅外光譜圖

2.3 BSA與活化硅膠結(jié)合量

按硅膠與BSA質(zhì)量比8∶1、4∶1、2∶1、1∶1進行表面覆蓋率的測定。稱取四份硅膠，每份0.5000 g，分別與0.0625、0.1251、0.2500、0.5000 g BSA反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后各取100 μL洗滌液采用考馬斯亮藍染色法[10]測定其中BSA含量，用BSA加入量與反應(yīng)剩余BSA量之差計算出結(jié)合量，按照下列公式計算出BSA的表面覆蓋率：表面覆蓋率=結(jié)合蛋白的物質(zhì)的量（μmol）/活化硅膠質(zhì)量（g）。結(jié)果顯示，活化硅膠與BSA質(zhì)量比為4∶1時，BSA結(jié)合量已基本達到飽和，加大劑量并不能明顯的增加鍵合量，表明BSA表面覆蓋率可能受空間位阻大小的影響。見圖2。

圖2 活化硅膠與BSA不同配比下的BSA表面覆蓋率

2.4 BSA固定相結(jié)合ASP研究

精密稱取ASP對照品50 mg，用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀釋至50 mL，搖勻，得到ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液。取ASP標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀釋至10 mL，各取10 μL用于HPLC。色譜條件：流動相：甲醇-20%冰醋酸（3∶1）；流速：1 mL/min；色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；紫外檢測器，λ=237 nm。得到ASP標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y = 97 941X+ 37 178，r = 0.9997，其中Y為峰面積，X為ASP濃度（μg/μL）。

稱取一定量的硅膠和BSA固定相勻漿法分別填裝于兩根柱子中，精密稱定適量的ASP，用中性乙醇溶解后緩緩傾注入色譜柱中，用蒸餾水洗滌柱子，接收洗滌液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算洗脫液中ASP含量，ASP加入量與洗脫液中ASP含量之差得到固定相對ASP的結(jié)合量，見圖3。對比硅膠固定相和BSA固定相對ASP的結(jié)合量，ASP與BSA固定相結(jié)合量明顯大于與硅膠固定相結(jié)合量，證明與ASP結(jié)合的主要是BSA而不是硅膠。

圖3 硅膠固定相、BSA固定相與阿司匹林結(jié)合量的比較

2.5 BSA色譜柱性能考察

篇3

Abstract: Filled chromatographic column meets the test requirements, but the chromatographic peak tailing phenomenon happens when testing. Changing the parameters and sample size, no significant improvement. Hollowing some distance at the intake end of filled chromatographic column, the chromatographic peak becomes normal and completely improved.

關(guān)鍵詞:色譜填充柱;柱效;探討;色譜峰

Key words: chromatography packed column;column efficiency;exploration;chromatographic peak

中圖分類號:S37文獻標(biāo)識碼:A文章編號:1006-4311(2010)18-0248-01

1問題的由來

1.1 按GB/T 18415-2001《小麥粉過氧化苯甲酰測定方法》規(guī)定的溶劑和進樣量分別進樣2μl丙酮、石油醚(60℃~90℃沸程),在注溫240℃ 條件下,1.6min以后,出現(xiàn)溶劑峰,但嚴(yán)重拖尾。

1.2 改用6#溶劑油飽和蒸氣進樣0.2ml,18秒后,出現(xiàn)溶劑峰,是個很尖的峰,沒有出現(xiàn)拖尾。

為什么會出現(xiàn)以上現(xiàn)象,實驗開始時懷疑可能柱子老化不完全造成的,我們對玻璃填充柱進行了24小時老化,沒有任何改善。反復(fù)檢查安裝過程,沒發(fā)現(xiàn)任何異常。大連物化所提供的玻璃填充柱的質(zhì)量是可靠的,我們又開始分析查找可能出現(xiàn)其它原因。

1.3 嘗試改變有關(guān)參數(shù),逐步降低或提高柱溫,增大減小載氣流量,燃氣和助燃氣流量,又分別注射2μl丙酮、石油醚,溶劑峰拖尾現(xiàn)象無明顯改善,又分別加苯甲酸的丙酮溶液,進樣2μl,濃度分別為15μg/ml、20μg/ml時,在7分鐘后出峰,在國標(biāo)準(zhǔn)法標(biāo)準(zhǔn)曲線最小濃度5μg/ml、10μg/ml,注射2μl,基本不出峰(或峰形不明顯)。這樣的情況顯然無法滿足工作需要,基本不能工作。

1.4 改變進樣量,分別以1μl,0.5μl丙酮進樣,溶劑峰峰形明顯好看,又以同樣的進樣量加入20μg/ml的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,溶劑與樣品峰出現(xiàn)分離,但樣品峰較小,其中進樣1μl時,濃度為20μg/ml 以上濃度的苯甲酸丙酮溶液,色譜峰有響應(yīng)值;進樣量為0.5μl,只有40μg/ml以上濃度的苯甲酸丙酮溶液時才有響應(yīng),分離效果還可以,因此可以說明色譜柱本身填充質(zhì)量問題不大,只是由于進樣量的減少,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(苯甲酸)要很大濃度才有響應(yīng),無法滿足工作需要,按國家標(biāo)準(zhǔn)來看,已經(jīng)沒有實際意義了,顯然必須進行改進。

1.5 經(jīng)分析,可能是樣品汽化過程有問題,會不會是汽化空間過小,出現(xiàn)類似死體積過大原因?qū)е峦衔?于是嘗試將柱子進氣端進行一些掏空,掏空1mm后,以2μl丙酮進樣試驗,峰形有較大改善,筆者又繼續(xù)掏空1mm后進行實驗,峰形完全改善,恢復(fù)正常,用石油醚實驗,情形大體相當(dāng)。于是又用苯甲酸丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣,測試最低檢出限,完全達到工作需要,恢復(fù)正常。

2原因分析

2.1 據(jù)資料介紹,拖尾峰的產(chǎn)生大致有這么幾種 :即色譜柱安裝位置不正確;柱子進樣口污染;溶劑極性不匹配;溫度過高;柱子液相流失等等。經(jīng)分析和認真檢查,在減小進樣量后,獲得明顯效果,于是進行少量挖空試驗。

2.2 樣品進入色譜柱之前,樣品有一個汽化過程,在240℃條件下迅速汽化,由于色譜柱汽化空間較小,在較短時間內(nèi)樣品汽化后體積較大,不能及時隨載氣完全進入色譜柱,造成一部分死體積過大,樣品進入柱子時間無法保持一致,分離過程不能同時進行,是一段一段地進入柱子進行分離,即使填充物完全合格也不會清晰的分離,最后就是出現(xiàn)大拖尾峰形。

2.3 使用6#溶油氣體進樣正是由于體積相對小得多就表現(xiàn)出正常狀態(tài),進一步說明了實驗所用溶劑是由于汽化不完全,無法正常隨載氣進入到色譜柱,形成較大的死體積造成了拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)。

2.4 由于樣品隨溶劑進入色譜柱,按一定比例保留一部分在過大的死體積內(nèi),所以在出峰部位(樣品保留時間)的樣品量過少,響應(yīng)值就很低,而且沒有辦法保證重復(fù)性。這樣的結(jié)果既降低檢出限,又不能保證準(zhǔn)確定量。因此會出現(xiàn)大濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品注入會出峰,而小濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品卻不能出峰或出峰很小的情況。

2.5 通常情況下,每提高柱溫30度,可以使分配系數(shù)減少一半,這樣是可以使前述實驗中的溶劑峰形稍顯好看一些,但卻不能改善柱效,溫度過高,一些液相會流失,因此在工作中不能過大隨意改變溫度,一定要在最高和最低溫度之間進行測試。降低柱溫可以改善分離效果,但不會改變拖尾現(xiàn)象,通過實驗,溫度改變和氣流改變確實對溶劑峰拖尾情況沒有改善。

3結(jié)論

3.1 根據(jù)氣色譜的塔板理論,塔板數(shù)越高分離效果越好,色譜柱一旦裝好,柱的塔板數(shù)在一定條件下是不會變化的,通過改變進樣量,不能提高柱效,相反過多的進樣量,可能對色譜柱有污染,從而降低柱效,我們在開始出現(xiàn)的現(xiàn)象,在客觀上就相對地“加大”了進樣量,從而造成原有的塔板無法滿足對樣品成分的分離作用,造成進樣口樣品堆積,就相當(dāng)于反復(fù)注入樣品,一次次從頭層析,重新分離,無法實現(xiàn)干凈的環(huán)境和準(zhǔn)確的進樣量,不能如實地反映出一組樣品組分在柱子中的行進情況。

3.2 根據(jù)氣相色譜的條件和國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定,我們的進樣量應(yīng)控制在一定的范圍內(nèi),一般液體樣品要在0.1-5μl,氣體在0.1-10ml之間,太低或太高的進樣量都可能改變標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限,是不可取的。因此采用減少進樣時來改變圖形效果沒意義。

3.3 分析本實驗出現(xiàn)的現(xiàn)象,我認為,正是色譜進樣端汽化腔過小,樣品來不及完全汽化或者汽化后無法一次進入柱子,造成溶劑峰的假拖尾現(xiàn)象,改變柱溫,無論增高或降低都沒有改善效果,是因為沒有解決問題的實質(zhì),通過減小進樣量,能夠改善峰形恰恰說明了這一問題,由于增大進樣端汽化腔,滿足了全部汽化所需空間條件,而明顯改善了圖形效果。根據(jù)塔板理論,我們所用的柱子塔板數(shù)在2000-3000以上,進樣前端少量掏空,對塔板影響不是很大,實驗結(jié)果也能體現(xiàn)出保證分離能力,是可行的。

3.4 將色譜柱的進樣少量掏空實驗,這和毛細管色譜柱將進氣端適量剪切方法差不多,可以在適當(dāng)?shù)那闆r下分析使用,也可以用來處理使用時間較長,可能有少量污染情況下的柱子,具體掏空多少,如何掏,應(yīng)通過實驗來慢慢進行,只要夠達到分離效果,檢出限也能達到要求就可以進行嘗試。

參考文獻:

[1]H?M?麥克奈爾,E?J 博內(nèi)利.氣相色譜基礎(chǔ)[M].林炳承,譯.北京:人民教育出版社,1979.

篇4

【摘要】 建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLCMS/MS)測定豬肉樣品中新型獸藥泰拉霉素殘留的方法。樣品用V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30混合溶液提取，經(jīng)離心后用PCX固相萃取小柱凈化， 以SymmetryC8色譜柱為分離柱，在串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。方法的線性范圍為10～500 μg/kg，檢出限為5.0 μg/kg，在3個濃度水平(10，20和50 μg/kg)進行添加實驗，平均回收率為93.1%～105.5%; 批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～4.6%; 批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8 %～5.6%。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜， 豬肉， 泰拉霉素， 殘留

1 引 言

泰拉霉素(Tulathromycin)是一種新近上市且為動物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，分子式為 C41H79N3O12(分子量806)，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號公告中首次批準(zhǔn)使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統(tǒng)疾病。具有用量少、一次給藥、低殘留、動物專用等優(yōu)點[1，2]。我國廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物為泰樂菌素和替米考星，雖然這兩種藥物的使用效果良好，但隨著使用時間的延長， 圖1 泰拉霉素分子結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Structure of tulathromycin在很多地區(qū)出現(xiàn)了不同程度的耐藥性[3]，而泰拉霉素藥效強于泰樂菌素、替米考星和氟苯尼考等市場廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，因此，泰拉霉素必將在畜禽生產(chǎn)中大量使用。作為一種新藥，泰拉霉素的殘留檢測方法的研究尤為必要。目前，大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法有ELISA篩選法[4]、薄層色譜法[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6]、高效液相色譜[7～10]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[11，12]。有關(guān)泰拉霉素的殘留檢測研究較少[13]。本研究建立了以羅紅霉素(C41H76N2O15， 837)為內(nèi)標(biāo)的泰拉霉素的HPLCMS/MS檢測方法，方法的定量限為10 μg/kg，可以滿足有關(guān)法規(guī)對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測要求，為動物組織中泰拉霉素的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司);固相萃取儀(美國Supelco公司);PCX固相萃取柱(3 mL， 60 mg， Agela公司);T25B組織勻漿機(德國Ika公司);RE120旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);MS1Minishaker旋渦混合器;EEVAP水浴氮氣吹干儀(美國Organomation公司);超純水器(美國MilliQ公司)。

泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品與羅紅霉素內(nèi)標(biāo)(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4為色譜純;甲酸、KH2PO4、　NH3·H2O為分析純;實驗室用水為MilliQ高純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取泰拉霉素10.0 mg，用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)定容至10 mL，搖勻，置冰箱冷藏儲存，有效期3個月。內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素的配制方法同泰拉霉素。

添加溶液的配制：吸取儲備液1 mL于100 mL容量瓶中并用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)混合液定容，再從中吸取1 mL于50 mL容量瓶中得添加液濃度為0.2 mg/L(冰箱冷藏儲存，有效期2個月)。

2.3 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的確定

由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)很少， 至今無泰拉霉素同位素內(nèi)標(biāo)物出售。而測定大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法研究和標(biāo)準(zhǔn)修制訂一般采用外標(biāo)法或者采用大環(huán)內(nèi)酯類某種結(jié)構(gòu)相似藥物作為內(nèi)標(biāo)物來進行定量分析。本實驗選用一種沒有用于獸藥用途且結(jié)構(gòu)與泰拉霉素非常相似的大環(huán)內(nèi)酯類藥物羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo)， 分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。 圖2 內(nèi)標(biāo)物羅紅霉素分子結(jié)構(gòu)式

Fig.2 Structure of roxithromycin as internal standard

2.4 供試樣品溶液的制備

稱取2.0 g組織樣品于50 mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10 mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30)和適量內(nèi)標(biāo)工作液，7800 r/min勻質(zhì)1 min后，5000 r/min離心2 min，收集上清液過已經(jīng)分別用3 mL甲醇和3 mL提取液潤洗過的60 g/3 L的PCX小柱，待全部過柱后，再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 4%氨化甲醇洗脫，50 ℃水浴氮氣吹干后用1 mL流動相定容，進行HPLCMS/MS分析。

2.5 LCMS/MS分析條件

SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，流動相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱溫：30 ℃，進樣室溫度15 ℃，進樣量：10 μL，流速為0.3 mL/min。

ESI(+); 多級反應(yīng)檢測(MRM); 毛細管電壓： 4.2 kV; 錐孔電壓： 20 V; RF透鏡電壓： 0.2 V; 離子源溫度： 110 ℃; 脫溶劑氣溫度： 350 ℃; 錐孔氣流速： 50 L/h; 脫溶劑氣流速： 600 L/h; 倍增器電壓： 650 V; 二級碰撞氣： 氬氣。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的提取和凈化

泰拉霉素含3個堿性的氨基基團，為弱堿性化合物，易溶于酸性溶液和極性溶劑中，在pH 6～8的水溶液中較穩(wěn)定，在酸性(pH9)條件下均不穩(wěn)定。對泰拉霉素殘留的提取和凈化方法的設(shè)計主要依據(jù)其弱堿性、脂溶性和酸不穩(wěn)定性。據(jù)文獻[3]報道， 乙腈和甲醇是組織中大環(huán)內(nèi)酯類藥物常用的提取溶劑，且采用酸化的乙腈或甲醇為提取溶劑可促進大環(huán)內(nèi)酯類抗生素從組織中溶出， 改善提取效率。本實驗比較了4種提取液：乙腈0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、甲醇0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、乙腈0.1%磷酸(70∶30， V/V)和甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)對泰拉霉素的提取效果。結(jié)果表明，甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)提取液對泰拉霉素的提取效果較好，回收率高于其它提取液，故本實驗選擇甲醇0.1%磷酸(70∶30)為樣品提取液。液液分配(LLE)和固相萃取(SPE)是大環(huán)內(nèi)酯類藥物的兩種主要凈化手段。液液分配操作比較麻煩且回收率相對較低， 重復(fù)性較差，所以本研究采用固相萃取技術(shù)凈化。比較了C18、Oasis MCX和PCX3種SPE凈化小柱， 由于Oasis MCX小柱和PCX小柱兼有陽離子交換和疏水作用機制，基于泰拉霉素的弱堿性和脂溶性的理化特性，Oasis MCX小柱和PCX小柱的凈化效果優(yōu)于C18小柱。Oasis MCX小柱和PCX小柱提取效率沒有明顯差別，但PCX小柱成本低，所以，本方法選擇PCX小柱。

3.2 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

3.2.1 液相色譜條件的優(yōu)化 泰拉霉素是弱堿性和脂溶性的極性化合物，通過選擇不同規(guī)格、不同填料的色譜柱和調(diào)節(jié)流動相中緩沖溶液的pH值、離子強度和有機溶劑(如乙腈或甲醇) 的含量，從而控制泰拉霉素的離子化強度和溶解性，使其在色譜柱上獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ艉陀行У姆蛛x。本實驗選用了SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，Venusil ASB C18柱(30 mm×2.1 mm， 5 μm)， XTerra MSC18柱(15 mm×2.1 mm， 3.5 μm)和XDBC18柱(50 mm×1.0 mm， 5 μm)4種不同規(guī)格、不同填料的色譜柱進行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用SymmetryC8色譜柱時，基線平穩(wěn)，峰形對稱，重現(xiàn)性好。流動相優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相為V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30等度洗脫時，可使泰拉霉素在SymmetryC8色譜柱上得到較好的分離效果和較高的靈敏度。

3.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 根據(jù)泰拉霉素的分子結(jié)構(gòu)的特征，選擇了ESI(+)為電離模式。通過流動注射直接進樣，對毛細管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、RF透鏡電壓、質(zhì)譜分辨率等條件進行了優(yōu)化，并最終確定本方法質(zhì)譜優(yōu)化條件為：毛細管電壓 4.2 kV，錐孔電壓 20 V，RF透鏡電壓0.2 V，離子源溫度 110 ℃，脫溶劑氣溫度 350 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h 。質(zhì)譜圖見圖3，母離子、子離子以及定性、定量離子對見表1。表1 泰拉霉素的定性、定量離子

3.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

電噴霧離子化( ESI)方法容易受樣品基質(zhì)的影響。實驗發(fā)現(xiàn)， 樣品基質(zhì)對離子化有非常強的抑制作用。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，以待測樣品制備對應(yīng)的空白樣品提取液，并以其作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)和樣品溶液具有同樣的離子化條件。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 方法的線性范圍與檢出限、定量限 在上述條件下，以基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量(標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖4所示)，泰拉霉素質(zhì)量濃度為10～500 μg/L時，線性關(guān)系良好，線性方程為Y=90.835X+0.187，(r=0.9993)。泰拉霉素的檢出限為5 μg/kg(S/N>3)，定量限為10 μg/kg(S/N>10)，超過了國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對大環(huán)內(nèi)酯類藥物檢測的靈敏度要求。

圖4 羅紅霉素(A)內(nèi)標(biāo)物和泰拉霉素(B，C)的色譜圖

Fig.4 Chromatograms of roxithromycin (A) as internal standard and tulathromycin (B， C)3.4.2 方法的回收率與精密度 取適量空白豬肉，進行3個濃度水平(10，20和50 μg/kg)的添加回收實驗，每個水平取5個平行樣(添加和空白色譜圖見圖5)，結(jié)果見表2所示。方法的回收率為93.1%～105.5%; 批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～4.6%; 批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8 %～5.6%; 滿足了藥物殘留分析的要求。表2 方法回收率及精密度

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篇5

關(guān)鍵詞 定量結(jié)構(gòu)-保留相關(guān)關(guān)系； 香精； 醛； 酮； 酯； 氣相色譜-質(zhì)譜； 氣相色譜-紅外光譜

1 引 言

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)結(jié)合了GC高效分離和MS定性專屬性強的優(yōu)勢，具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強的特點，可同時完成待測組分的分離鑒定，適用于混合物中未知組分的定性和定量分析，在食品[1]、環(huán)境[2]、醫(yī)藥[3]、化工[4]等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。但氣相色譜的色譜柱容量有限，同系物或異構(gòu)體化合物的色譜保留時間相近或一致[5]。雖然GC-MS配置的NIST數(shù)據(jù)庫中已包含超過20萬張化合物的EI質(zhì)譜圖譜，但在含有較多同系物和同分異構(gòu)體的復(fù)雜樣品分析中，有些化合物在EI（與GC常聯(lián)用的離子化方式）電離方式下不產(chǎn)生分子離子峰；利用譜庫檢索一般只能給出某個成分的可能匹配物質(zhì)，一些結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的EI質(zhì)譜圖較為相似，僅僅依靠GC-MS得到的結(jié)果對化合物進行定性并不十分充分，需要通過其它電離技術(shù)獲得分子量信息，或采用多級質(zhì)譜（MSn）技術(shù)獲得結(jié)構(gòu)信息。研究者常通過與其它定性方法聯(lián)用、建立指紋圖譜[6]或化學(xué)計量學(xué)[7]的手段來彌補NIST數(shù)據(jù)庫在同系物和異構(gòu)體鑒定分析中的不足。氣相色譜-紅外光譜（GC-IR）聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了GC良好的分離能力和IR結(jié)構(gòu)鑒定的優(yōu)勢，適合復(fù)雜未知物成分分離及其定性定量分析。另一方面，定量結(jié)構(gòu)保留相關(guān)關(guān)系（QSRR）是直接利用分子結(jié)構(gòu)信息關(guān)聯(lián)和預(yù)測有機物的色譜保留時間[8]。多元線性回歸模型是QSRR中應(yīng)用廣泛的一種經(jīng)典建模方法，它對自變量和因變量加以線性擬合得到最小二乘意義下的最佳結(jié)果，在環(huán)境、食品、化工等領(lǐng)域未知化合物的分離分析中得到廣泛應(yīng)用[9～15]。

香精香料是食品香味的主要來源之一，它們使制造食品的香味能夠與傳統(tǒng)手工制作的食品相媲美。香精香料已經(jīng)廣泛應(yīng)用到食品生產(chǎn)的各個領(lǐng)域，它能改善食品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本、增加食品的色香味，大大提高了人民的生活質(zhì)量和品味，同時促進了食品工業(yè)的快速發(fā)展[16]。醛酮酯類化合物是重要的工業(yè)原料、藥物原料、合成中間體，也是合成香精香料的重要組成之一[17]。目前，醛酮酯類化合物的QSRR方面的相關(guān)研究已多有報道[18～24]。

本研究采用QSRR輔助GC-MS/IR方法快速定性分析飽和醛酮酯同系物及其同分異構(gòu)體。以醛酮酯標(biāo)樣保留時間tR為因變量，分子拓撲指數(shù)0Q為自變量，構(gòu)建簡單醛酮酯類化合物定量結(jié)構(gòu)-保留相關(guān)關(guān)系（QSRR），采用本方法輔助GC-MS/IR方法建立快速、準(zhǔn)確的香精樣品中醛酮酯類化合物定性分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

GC 6890N氣相色譜（美國Agilent公司）；IR 6170紅外光譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），另配有FID檢測器；6890/5790氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，美國Agilent公司）。

2-戊酮、3-戊酮、2-己酮、4-庚酮、5-甲基-2-己酮、3-辛酮、正己醛、1-辛醛、丙酸乙酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯、丁酸異戊酯、丁酸正戊酯、異戊酸異戊酯、丁酸己酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕櫚酸甲酯、三醋酸甘油酯（純度≥99.5%，阿拉丁試劑公司）；正己烷（色譜純，百靈威公司（上海））。香精等樣品由某企業(yè)提供。

各標(biāo)準(zhǔn)品以正己烷為溶劑，配制成1000 mg/L儲備液備用；單標(biāo)使用液和混標(biāo)使用液根據(jù)需要由儲備液用正己烷稀釋而成。

2.2 分析條件

2.2.1 GC-MS條件

色譜柱： Agilent HP-VOC（60 m × 0.32 mm × 1.80 μm）； 進樣口溫度： 260℃； 質(zhì)譜接口溫度270℃，離子源溫度230℃，電離方式為 EI，電子轟擊能量 70 eV；載氣為高純He，柱流速1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流進樣，分流比為25∶1；程序升溫：以5℃/min的速率從70℃升至270℃。

2.2.2 GC-IR/FID條件 Agilent HP-VOC色譜柱 （60 m × 0.32mm × 1.80 μm）；進樣口溫度： 260℃，F(xiàn)ID檢測器溫度：250℃；載氣為高純He，柱流速1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流進樣，分流比為5：1；程序升溫：以5℃/min的速率從70℃升至270℃；紅外光譜分辨率：16 cm1，掃描次數(shù)：8次；GC-IR接口傳輸線溫度：270℃，光管溫度：270℃。

2.3 樣品處理

在0.2 mL香精樣品中加入0.5 mL 正己烷，振蕩2 min后，用1 mL 注射器吸取上清液，重復(fù)3次，得到1 mL萃取液，備用。

2.4 分子拓撲指數(shù)0Q

3 結(jié)果與討論

3.1 GC-MS和GC-FID/IR中醛酮酯化合物的保留時間

結(jié)合GC-IR可對未知物進行官能團鑒定的特點，輔助GC-MS定性分析復(fù)雜樣品中的醛酮酯類化合物。本研究首先考察了醛酮酯類化合物在不同方法中的色譜保留時間（表1）。結(jié)果表明，采用同一方法和同型色譜柱，由于GC-IR接口構(gòu)造特殊，餾出物在氣紅接口中滯留時間較長，導(dǎo)致醛酮酯化合物在GC-MS和GC-IR/FID中保留時間不同，但色譜保留時間順序基本一致，相應(yīng)化合物的保留時間差值近似為常數(shù)，這為GC-IR輔助GC-MS用于復(fù)雜樣品中未知物的分析鑒定奠定了基礎(chǔ)。

3.2 QSRR模型建立

將17種飽和酯類化合物分為兩類，其中7種乙酯類同系物（丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯）作為訓(xùn)練集，推測對應(yīng)關(guān)系式；剩余的不同取代基的其它酯類化合物作為預(yù)測集，用于檢驗方法準(zhǔn)確性。飽和酯類化合物的Q值、在GC-MS方法中保留時間實驗值見表2。由表2可知，乙酯類同系物的色譜保留時間與其分子結(jié)構(gòu)參數(shù)Q值間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997。由于這些乙酯類同系物都是直鏈羧酸基乙酯，在GC中存在良好的碳數(shù)規(guī)律。因此，本對應(yīng)關(guān)系式與同系物碳數(shù)規(guī)律結(jié)果一致。此對應(yīng)關(guān)系式對其它酯類化合物的保留時間預(yù)測值也列于表2。

由于作為預(yù)測集的酯類化合物與訓(xùn)練集的乙酯類化合物的結(jié)構(gòu)存在較大差異，單獨采用保留時間碳數(shù)規(guī)律無法得到良好的預(yù)測。但經(jīng)過分子拓撲結(jié)構(gòu)處理后的結(jié)果表明，酯類化合物的保留時間與其對應(yīng)的Q值能很好地符合此線性關(guān)系，預(yù)測值與實驗值的偏差不超過5%。

對于醛酮類化合物，以2-戊酮、3-戊酮、2-己酮、4-庚酮及5-甲基-2-己酮作為訓(xùn)練集，將醛酮化合物在不同方法上的色譜保留時間（tR）與相應(yīng)化合物的0Q進行多元線性回歸分析。結(jié)果表明，tR與0Q具有良好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)R2=0.997。其中醛酮化合物在GC-MS方法中色譜保留時間（tR）與0Q的擬合方程為：

tR=0.9090Q-8.141（4）

以4-庚酮、3-辛酮、1-辛醛和4-壬酮為測試集，用公式（4）對測試集在GC-IR方法中的色譜保留時間進行預(yù)測，所得預(yù)測值及其與實驗值的相對偏差見表3。結(jié)果表明，測試集化合物的預(yù)測值與實驗值的相對偏差小于3.4%，表明模型預(yù)測能力較強。

3.3 QSRR輔助GC-MS/IR方法在復(fù)雜樣品醛酮酯類化合物鑒定中的應(yīng)用

3.3.1 香精樣品1#分析 采用GC-MS分析香精樣品1#的正己烷萃取液（圖1A）。通過NIST質(zhì)譜圖譜庫搜索，其中9、16、19和24號峰可能為醛酮類化合物，相應(yīng)化合物及其匹配度見表4。

由圖1A可見，3號和16號譜峰的匹配度并不高，而24號譜峰不僅質(zhì)譜匹配度低，而且給出了相似匹配度的不同化合物。本研究進一步采用GC-IR分析該樣品（圖1B），結(jié)合IR譜庫鑒定結(jié)果，可以基本確定譜峰9和19為醛酮類化合物，峰3為酯類化合物，但具體結(jié)構(gòu)無法確定。

為了準(zhǔn)確確定這些醛酮酯類化合物的同系物結(jié)構(gòu)，采用QSRR模型進一步處理。表5給出了6～14個碳直鏈飽和醛的0Q值及其根據(jù)已知模型中擬合公式得到的色譜保留時間預(yù)測值。

為壬醛。而24號峰（十三醛和十四醛）相應(yīng)的色譜保留時間預(yù)測值與實驗值相對誤差相當(dāng)大，初步判斷MS譜庫推薦的兩個可能結(jié)果均不正確。根據(jù)保留時間預(yù)測值與實際色譜保留時間判斷，24號譜峰應(yīng)為十一醛。通過標(biāo)準(zhǔn)樣品對預(yù)測結(jié)果進行核實， 3號峰為丁酸乙酯；16號峰為壬醛；24號峰為十一醛，證明采用QSRR結(jié)合GC-MS/IR能準(zhǔn)

確判斷未知化合物的結(jié)構(gòu)。

3.3.2 香精樣品2#分析 香精樣品2#經(jīng)正己烷處理后的GC-MS分析結(jié)果見圖2，通過NIST質(zhì)譜譜庫搜索給出的相應(yīng)化合物及其匹配度見表6。

結(jié)果表明，雖然GC-MS NIST譜庫和GC-IR都顯示香精樣品2#中含有多個酯類化合物，但GC-MS對多個酯類化合物的同系物給出了匹配度相近的可能結(jié)果，單獨通過GC-MS或通過GC-IR輔助MS難以準(zhǔn)確簡單酯類化合物同系物的結(jié)構(gòu)。為此，本研究通過NIST推薦的化合物的0Q值并結(jié)合QSRR已建立的模型進行預(yù)測。結(jié)果表明，辛酸乙酯、十二酸乙酯、癸酸異戊酯和十五酸乙酯的預(yù)測保留時間與實驗中2， 8， 9和10號峰的保留時間吻合度較好，進一步采用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品進行對比，最終確定預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

根據(jù)分子拓撲指數(shù)0Q和色譜保留時間關(guān)系，建立了醛酮酯類化合物的QSRR模型tR=0QA+B，該模型因變量、自變量具有較好的線性相關(guān)性，預(yù)測能力良好。采用GC-MS、GC-IR對香精樣品分離分析并進行初步定性，利用所建立的tR-0Q模型對初步定性結(jié)果輔助定性確定準(zhǔn)確的定性結(jié)果，確立了快速、準(zhǔn)確判定香精香氣等復(fù)雜樣品中未知化合物結(jié)構(gòu)的分析方法。本方法中氣相色譜采用的色譜柱均為HP-VOC柱，在其它色譜柱體系，本方法并不適用。另外，本方法的tR-0Q模型對脂肪族飽和醛酮酯類化合物的能夠準(zhǔn)確定性，但對苯系物或不飽和化合物的定性誤差較大。

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篇6

【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮殘留量的測定方法。方法 色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：292nm；進樣量：40μl。結(jié)果 樣品的室內(nèi)加標(biāo)平均回收率為86.7％～91.8％，室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5％～6.0％，室間加標(biāo)平均回收率為81.4％～95.0％，室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.7％～7.1％，定量測定低限（LOQ）為10μg/kg。結(jié)論 本方法簡便，準(zhǔn)確，可用于脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮殘留含量的測定。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法;脂肪;醋酸美侖孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮

Determination of progestones in fat of beef and pork by HPLC

【Abstract】 Objective To establish the determination method of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.Methods Chromatographic separation was carried out on a C18column（250mm×4.6mm，5μm）and acetonitrile-water (65:35) as the mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min; the column temperature was 35℃; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40μl.Results The intra-laboratory average recoveries ranged from 86.7％～91.8％ and RSD of 4.5％～6.0％.The inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from 81.4％～95.0％ and RSD of 3.7％～7.1％.The lowest limit of quantitation (LOQ) is 10μg/kg.Conclusion The method is simple and sensitive.It is suitable for the determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.

【Key words】 HPLC; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate

醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮為合成的孕激素類藥物，有明顯的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素對垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用，動物實驗表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)惡心、頭暈、倦??；(2)突破性出血；(3)孕期服用，會增加女性后代的男性化作用。孕激素類藥物能增強體內(nèi)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)性能，可以很快產(chǎn)生顯著和直接的經(jīng)濟效益，因此，對生產(chǎn)者有很大的吸引力。畜牧業(yè)中使用孕激素類藥物(非治療用途)已有很長的歷史，但人類長期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦會明顯影響機體的激素平衡，而且有致癌危險，對幼兒造成發(fā)育異常等危害。因此，開發(fā)一種能檢測孕酮殘留量的方法是十分必要的。

檢測孕激素類藥物的方法有很多，如液相色譜/質(zhì)譜法（LC/MS）［1］、氣相色譜/質(zhì)譜法（GC/MS）［2，3］和液相色譜法［4～6］等。本文采用高效液相色譜法對牛和豬脂肪樣品中的孕酮進行檢測。

1 試劑與儀器

1.1 試劑 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品（Sigama公司），乙腈（HPLC級），甲醇（HPLC級），乙酸乙酯（HPLC級），其他試劑為分析純。水由Milli-Q凈化系統(tǒng)（Millipore公司）制得。

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1000μg/ml，分別準(zhǔn)確稱取0.050g醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。

（2）混合中間溶液I：100μg/ml，分別吸取10.0ml醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。

（3）混合中間溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml混合中間溶液I于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。

（4）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取10、20、40、80、100μl混合中間溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水（65:35）中，再加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，得到濃度為0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml和0.10μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜測定，當(dāng)日使用。

1.2 儀器 Waters液相色譜系統(tǒng)，510泵體，486紫外-可見光檢測器，Emprower pro色譜軟件。氮氣吹干儀（Organomation Associates，Jnc.公司）；固相萃取裝置（Supelco公司）；低溫離心機（德國Eppendorf公司）；渦旋混勻器（XW-80A型，上海醫(yī)大儀器廠）；CN固相萃取柱（3ml，Waters公司）。

2 測定步驟

2.1 試樣的制備與保存

2.1.1 試樣的制備 把大約5g的豬或牛脂肪組織切成小塊，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的燒杯中，將燒杯置于微波爐內(nèi)。根據(jù)所熬制脂肪量，使用最大功率，加熱30～60s，如果脂肪沒有融化，可在間隔30～60s以后重復(fù)加熱30～60s，直到有液體脂肪流出，通過漏斗滴入燒杯中。把熬制好的脂肪油放入樣品瓶中，密封，并做上標(biāo)記。

2.1.2 樣品的保存 把熬制好的脂肪油樣品置于-18℃中，冷凍保存。

2.2 提取 稱取熬制好的脂肪油2.00±0.01g，置于50ml具塞離心管中，加入5ml乙腈，于60℃水浴中保溫3min以使固體脂肪溶化，渦旋振搖1min，在-5℃下離心7min（離心力1160g），吸取上清液至15ml帶塞聚丙烯離心管，再在沉淀物中加入5ml乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，渦旋振搖1min，于-5℃中離心5min（離心力1160g），棄去正己烷層。乙腈提取液于60℃中用氮氣吹干儀吹干，殘渣待皂化。

2.3 皂化 在殘渣（2.2項）中依次加入4ml正己烷、1ml 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液和0.5ml1.0mol/L氯化鎂溶液，于渦旋混勻器上快速混勻10s，在60℃水浴中保溫15min，于-5℃中離心5min（離心力1160g），吸取上清液至15ml玻璃試管。在沉淀物中再加入4ml正己烷混勻后，在60℃水浴中加熱15min后，在-5℃中離心5min（離心力1160g），合并上清液。于60℃中用氮氣吹干儀吹干，用1.0ml正己烷溶解殘渣，待凈化。

2.4 凈化 將皂化后的樣液（2.3項）倒入經(jīng)5ml乙酸乙酯和6ml正己烷預(yù)處理過的CN柱中，用2×1ml正己烷潤洗玻璃試管，洗液倒入到CN柱中。待樣液流過后，依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，隨后打開真空泵將小柱中液體抽干，保持抽氣2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫，洗脫液收集于15ml玻璃試管中，于60℃中用氮氣吹干儀吹干。殘余物用990μl乙腈-水（65:35）渦旋溶解，靜止15min后，加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，供液相色譜測定。

2.5 測定

2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；預(yù)柱：C18柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：292nm；進樣量：40μl。

2.5.2 液相色譜測定 根據(jù)樣液中3種孕酮的含量情況，選定濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液中3種孕酮的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液等體積參樣測定。在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色譜圖（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美侖孕酮

3 結(jié)果與討論

3.1 線性范圍 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮濃度在0.010～0.10μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)（γ2）均大于0.998。

3.2 回收率、精密度和定量檢測限 本實驗以2種脂肪（牛脂肪和豬脂肪）作為樣本。取適量標(biāo)準(zhǔn)品加入到2.0g樣品中，使添加量相當(dāng)于10、20和50μg/kg，每個添加水平各取24份試樣（每種脂肪各12份）。圖2為空白脂肪樣品和添加樣品（10μg/kg）的色譜圖。表1為醋酸美侖孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外標(biāo)法測得的室內(nèi)回收率和精確度。表2為8家實驗室的室間回收率和精確度結(jié)果。根據(jù)回收率試驗，能可靠測得的最低濃度確定定量檢測限（LOQ），LOQ為10μg/kg，滿足殘留限量的檢測要求。

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篇7

實驗方法試劑與藥品

本實驗中豬肉由本地市場采購。所有試劑都是質(zhì)譜純級，高效液相純級或分析純級。乙腈和水由Scharlau公司提供。乙酸乙酯、異丙醇由Fisher公司提供。標(biāo)準(zhǔn)物均采購自國家藥品生物制品檢定所(NICPBP)，以甲醇配制單個標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0mg／mL)，并在4℃下冷藏。以甲醇－水(10：90)配制合并工作溶液(10μg／mL)，并在4℃下冷藏。添加溶液應(yīng)每周配制，以適當(dāng)稀釋合并工作溶液來制備。

設(shè)備與材料

安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)，安捷倫6460三重四極桿液相色譜一質(zhì)譜／質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，安捷倫SamliQ SCX聚合物柱，50×3mL管，60mg(部件號：5982－3236)，安捷倫ZORBA×EcipsePlus C18色譜柱，50×2.1mm，1.8μm(部件號：959741-906)，安捷倫真空歧管處理盒(部件號：5982-9120)。

樣品制備

液－液提取：于1.5mL帶蓋聚丙烯管中稱取2g豬肉(精確至±0.01g)。加入8mL0.2M的乙酸鈉(pH值5.2)溶液，并渦旋以混合均勻。然后加入β2－葡萄糖醛酸酶(1000U／mL)100μL，并渦旋混合2分鐘。樣品在37℃下水解16小時，水解產(chǎn)物經(jīng)震動處理15分鐘后，在離心機中用4000 rpm的速度離心分離10分鐘。取4m上層清液至另一離心管中，加入5mL、0.1 M高氯酸溶液并調(diào)節(jié)pH值至1±0.3，再在離心機中以4000 rpm的速度離心分離10分鐘。將上層清液移至另一試管中，用10M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值至11。

于樣品試管中分別添加10mL飽和氯化鈉溶液和異丙醇一乙酸乙酯(60：40)混合液，并震動處理5分鐘。以4000 rpm離心分離5分鐘后，將有機層仔細轉(zhuǎn)移至另一離心管中。將異丙醇一乙酸乙酯混合液的添加、震動處理，離心分離和轉(zhuǎn)移有機液層的過程重復(fù)兩次，并將所有上清液合并。樣品于40℃以氮氣吹干，并將殘留物復(fù)溶于5mL、0.2M的乙酸鈉(pH值5.2)溶液中。該樣品將用于固相萃取純化。

固相萃取

固相萃取過程(SPE)如圖1中所示。先用3mL甲醇活化安捷倫SampliQSCX柱，然后用3mL水平衡。取5mL樣品溶液載入到柱中，并以重力通過色譜柱(約1 mL／min)。用2mL水和2mL、2％甲酸水溶液；中洗SPE／小柱，丟棄所有洗脫液。真空抽干SPE／小柱。最后以5mL、5％氨甲醇溶液洗脫，流速約為1mL／min。洗脫液于40℃氮氣吹干，殘留物復(fù)溶于1mL、0.1％甲酸的水／乙腈(90：10)溶液。樣品經(jīng)渦旋混合和超聲波處理以完全溶解后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，并在3000 rpm條件下處理5分鐘。最后將樣品轉(zhuǎn)移至2mL的色譜小瓶中等待分析。

儀器條件

高效液相色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX EcllpsePlus C18色譜柱，50×2 1mm，1.8μm(部件號959741-906)，

流速0.4mL／mln；

柱溫40℃：

進樣體積：5μL：

流動相：水(0.1％甲酸溶液+2mM乙酸銨，A)；

乙腈(0.1％甲酸，B)；

梯度淋洗：

質(zhì)譜條件

在正極模式下對4種化合物進行了監(jiān)測。離子源條件如圖2所示，多反應(yīng)監(jiān)測通道如表2中所示。

結(jié)果與討論線性與檢測限

實驗中標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(0.2b、0.5、1.0，2.0和5.0ng／g)是以添加適量混合工作溶液于空白基質(zhì)來配制的?？瞻谆w是通過將豬肉進行水解、液液萃取和固相萃取來制備的。校準(zhǔn)曲線的結(jié)果如表3中所示。檢測限(LOD)定義為每個化合物給出信噪比(S／N)大于3:1時的濃度。各化合物的檢測限也列于表3中。

回收率與重現(xiàn)性

在豬肉中分別添加標(biāo)樣濃度為0.5、1.0、2.0ng／g，計算回收率和重現(xiàn)性。每個濃度重復(fù)分析6次。回收率和重現(xiàn)性數(shù)據(jù)列于表4中。添加豬肉萃取物(1.0ng／g)的色譜圖如圖3中所示。

結(jié)論

篇8

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜法； 痕量殘留； 豬尿液； 瘦肉精

1 引 言

“瘦肉精”（Lean meat agents）最早是鹽酸克倫特羅的俗稱，現(xiàn)在泛指一類可以促進動物生長，提高瘦肉率的藥物[1]，主要包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林等β.受體激動劑，以及近年來監(jiān)測發(fā)現(xiàn)的賽庚啶、可樂定等具有促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率的化合物[2]。由于上述藥物在動物性食品中的極易殘留，會對食用者產(chǎn)生系列毒副作用，因此，包括我國在內(nèi)的許多國家和國際組織已經(jīng)制定了極其嚴(yán)格的規(guī)定。到目前為止，我國已明確禁止在食品動物養(yǎng)殖過程中使用克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林、多巴胺、班布特羅、齊帕特羅、馬布特羅、西馬特羅、溴布特羅、福莫特羅/阿福特羅、特布他林、賽庚啶、可樂定共15種具有促進動物生長、提高瘦肉率的藥物[1]。

近年來，我國加大了對明令禁止的上述15種“瘦肉精”非法使用的打擊力度，“瘦肉精”藥物在畜禽養(yǎng)殖中的非法使用得到了有效遏制，然而具有促進動物生長、提高瘦肉率功效、而未被列入國家禁用藥物名單的β.受體激動劑同系物或衍生物（如克羅潘特、羥甲基克倫特羅、克倫丙羅、西布特羅、妥布特羅、馬噴特羅、噴布特羅、卡布特羅、丁酚胺、利托君、克倫己羅、克倫塞羅、異克倫潘特、溴氯特羅、苯氧丙酚胺等）極易被不法分子利用，作為新型“瘦肉精”替代物，用于生豬養(yǎng)殖過程中，達到非法牟利的目的，進而威脅廣大消費者的健康安全。

尿液常被選擇作為藥物代謝、殘留消除實驗的重要靶組織，而且，與其它組織樣品相比，尿液在樣品采集過程中可有效避免對動物造成損傷，因此，動物尿液通常作為大批量樣品監(jiān)測的測試對象[3]。近年來，研究者針對動物尿液中β.受體激動劑藥物殘留建立了包括液相色譜[4]、氣相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜[5]、液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜[3，6～11]、ELISA[12]、膠體金試紙法[13]、免疫傳感器[14]、液相芯片法[15]等一系列快速檢測及定量確證檢測方法。而賽庚啶、可樂定作為新型“瘦肉精”藥物，分別屬于H1受體拮抗藥和α2.受體激動劑[14，15]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與β.受體激動劑藥物有較大的差異（各藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1），理化特性、色譜行為也有較大差別，因而同時檢測賽庚啶、可樂定與β.受體激動劑的方法鮮有報道[16]。

本研究建立了超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜快速、簡單地同時測定豬尿液中30種不同種類“瘦肉精”藥物（賽庚啶、可樂定及28種β.受體激動劑類）殘留的方法，為加強生豬養(yǎng)殖、屠宰過程中違法使用不同種類“瘦肉精”的監(jiān)管提供了可靠的技術(shù)支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AcquityTM UPLC.Xevo TQ MS超高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）、UPLC CSH C 18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、固相萃取裝置、Oasis MCX固相萃取柱（60 mg， 3 mL）均為美國Waters公司產(chǎn)品； 5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）； 氮吹儀（美國Organomation公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品： 鹽酸克侖特羅（Clenbuterol hydrochloride， 98.5%）、鹽酸溴布特羅（Brombuterol hydrochloride， 98.5%）、鹽酸班布特羅（Bambuterol hydrochloride， 98.0%）、萊克多巴胺（Ractopamine， 97.0%）、沙丁胺醇（Salbutamol， 100%）、鹽酸克倫潘特（Clenpenterol hydrochloride， 99.5%）、羥甲基克倫特羅（Hydroxy.methyl clenbuterol， 99.0%）、克倫丙羅（Clenproperol， 99.0%）、特布他林（Terbutaline， 985%）、非諾特羅（Fenoterol， 100 mg/L， 溶于乙腈）購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司； 苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A， 98.0%）、鹽酸馬布特羅（Mabuterol hydrochloride， 99.0%）、齊帕特羅（Zilpaterol， 98.0%）、卡布特羅半硫酸鹽（Carbuterol Hemisulfate Salt， 98.0%）、硫酸丁酚胺（Bamethane sulfate， 98.0%）、苯氧丙酚胺（Isoxsuprine， 98.0%）購自Toronto Research chemicals INC公司； 鹽酸利托君（Ritodrine， 98.0%）購自Tokyo Chemical Industry公司； 鹽酸可樂定（Clonidine hydrochloride）、鹽酸賽庚啶（Cyproheptadine hydrochloride）購自European Pharmacopoeia公司； 氯丙那林（Clorprenaline， 99.0%）、西布特羅（Cimbuterol， 99.0%）、西馬特羅（Cimaterol， 99.0%）、妥布特羅（Tulobuterol， 99.0%）、克倫己羅（Clenhexerol， 99.6%）、鹽酸克倫塞羅（Clencyclohexerol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸異克倫潘特（Clenisopenterol hydrochloride， 99.7%）、鹽酸馬噴特羅（Mapenterol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸溴氯特羅（Bromchlorbuterol hydrochloride， 99.0%）、鹽酸噴布特羅（Penbutolol hydrochloride， 99.0%）購自Witega Laboratorien BerlinAdlershof GmbH公司； 酒石酸福莫特羅 （Formoterol tartrate， 98.0%）購自美國International Laboratory 公司。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品（10.00±0.10）mg， 以甲醇溶解并定容至10 mL， 即為各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。分別量取適量的30種藥物儲備液于另一潔凈10 mL容量瓶中混合，配制100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液， 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確量取尿液5.00 mL于50 mL具塞離心管中，5000 r/min離心5 min，將上清液用5%乙酸溶液調(diào)至pH 3.0后，加入經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX柱，分別用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，真空泵抽干后以3 mL 5%氨化甲醇洗脫，45℃水浴條件下N2吹近干，用1 mL 0.1%甲酸.乙腈（9∶1， V/V）溶液復(fù)溶，UPLC.MS/MS檢測。

2.4 色譜.質(zhì)譜條件

色譜條件： 流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，液相洗脫梯度程序： 0～1.0 min，95% A； 1.0～3.0 min，95%～87% A； 3.0～4.0 min，87%～60% A； 4.0～5.0 min，60%～10% A； 5.0～5.1 min，10%～95% A； 5.1～7.0 min，95% A。進樣量： 5 μL，柱溫： 35℃，流速： 0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。毛細管電壓2700 V，離子源溫度150℃，霧化室溫度450℃，去溶劑氣（氮氣）流量： 1000 L/h； 錐孔氣（氮氣）流量： 50 L/h； 碰撞氣（氬氣）流量： 0.24 L/h。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜參數(shù)的確定

選擇一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Intelstart軟件，以ESI正離子模式對待測藥物進行母離子確認及子離子全掃描。確定以[M+H]+作為各藥物的分子離子，分別對儀器的錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，進行子離子掃描，選取2個豐度強、穩(wěn)定的碎片離子作為定性與定量離子，以滿足歐盟2002/657/EC[17]對于禁用藥物L(fēng)C.MS/MS方法的定性監(jiān)測的規(guī)定，即滿足1個母離子、2個子離子共4個鑒定點數(shù)的要求。因此，本方法根據(jù)待測藥物的保留時間，采用分段掃描的方式對不同藥物的特征離子進行數(shù)據(jù)采集，以提高靈敏度。30種藥物的保留時間及定性、定量離子等參數(shù)見表1。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

由于28種β.受體激動劑藥物具有較為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)及相近的色譜保留特性，而可樂定和賽庚啶與β.受體激動劑藥物化學(xué)性質(zhì)、色譜行為差異較大[16]，為了將上述藥物在盡可能短的時間內(nèi)有效分離，本實驗分別考察了BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）4種型號的色譜柱對30種目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，HSS T3色譜柱對目標(biāo)化合物的保留能力較弱，尤其是沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林等12種極性較強的藥物，即使用含量低于5% 的乙腈進行淋洗，其保留時間均小于1.0 min， 且不能有效分離。其余3種色譜柱均能有效保留30種藥物，而采用CSH C 18色譜柱較BEH C 18和Shield RP 18色譜柱，可有效分離上述藥物，且各化合物峰形尖銳。圖2為30種典型的瘦肉精的空白和加標(biāo)樣品色譜圖。

為了更好地將待測物有效分離，降低共流出物基質(zhì)干擾，本實驗還考察了甲醇、乙腈分別與水、0.1%甲酸及含 50 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液等作為流動相，對目標(biāo)化合物的峰形、分離度、靈敏度等的影響。結(jié)果表明，流動相中添加甲酸后，待測物的信號強度明顯提高，且藥物保留時間有所提前； 而以50 mmol/L甲酸銨.0.1%甲酸溶液作為流動相時，待測物的信號強度、分離度等與0.1%甲酸溶液無顯著差異。甲醇和乙腈作為流動相對信號強度的影響不顯著，而甲醇作為流動相進行梯度洗脫時，色譜柱壓差變化范圍較大，平衡時間延長。因此，本實驗采用UPLC CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分析柱，以乙腈.0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫。30種“瘦肉精”藥物可在5.0 min內(nèi)實現(xiàn)良好分離，各藥物的定量離子的提取離子色譜圖如圖2所示。

3.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

本方法采用將尿液簡單離心，直接用MCX固相萃取柱凈化的樣品前處理方法。為了充分確保本方法的可靠性，本實驗考察了文獻[5，19～21]所采用的樣品前處理方法（需酶解、液液萃取和/或固相萃取等步驟），分別采用叔丁醇.叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯/異丙醇[5，20]、HClO4[20，21]等試劑對豬尿樣品中待測藥物的提取，對各操作方法的提取操作步驟、所需的主要化學(xué)試劑及數(shù)量、方法的回收率、精確度等技術(shù)參數(shù)進行比較。檢測結(jié)果表明，本方法不僅可獲得較為滿意的方法準(zhǔn)確度、精確度（如表2所示，本實驗采用尿液經(jīng)離心后直接凈化，30種藥物的回收率在67.6%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～16.8%），滿足藥物殘留定量確證檢測的要求，而且操作步驟簡單、快速，試劑使用量少，不需要復(fù)雜的樣品前處理步驟，平均每個樣品的提取、凈化過程僅使用很少量的有機溶劑（約7 mL甲醇），較文獻[5，19～21]大大減少了有機溶劑的使用量，尤其是高氯酸等鹵素試劑的使用量。本方法可作為環(huán)境友好型的樣品前處理方法，適用于豬尿液樣品中不同種類“瘦肉精”多殘留大批量樣品的篩選及確證檢測。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限 在上述最佳色譜.質(zhì)譜條件下，將空白豬尿樣品按照2.3節(jié)進行樣品處理，在洗脫液中加入一系列30種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1， 0.3， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10.0 μg/L），LC.MS/MS進行檢測，以各組分的濃度與其定量離子峰面積進行線性回歸，呈良好的線性關(guān)系（r2>0.992）。以3倍信噪比（S/N）計算，本方法測定豬尿液中30種“瘦肉精”藥物的檢出限為0.1 μg/L； 以l0倍信噪比（S/N）計算，定量限為0.3 μg/L。

3.4.2 準(zhǔn)確度和精密度 本實驗，分別在豬尿液中以3個濃度水平（0.3， 0.6和3.0 μg/L）進行空白樣品加標(biāo)回收實驗，考察方法的回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，以基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線進行校正，結(jié)果如表2所示。30種“瘦肉精”藥物的平均回收率在67.6%～103.2%之間，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.8%～16.8%和2.6%～15.8%。

3.5 實際樣品的檢測

運用本方法對浙江省某生豬屠宰場隨機抽取的100份豬尿液進行測定，與農(nóng)業(yè)部1025號公告.11.2008[5]和農(nóng)業(yè)部1063號公告.3.2008[19]兩個標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果基本一致，有1份樣品檢出萊克多巴胺殘留，其余樣品均未檢出“瘦肉精”藥物殘留。利用本方法及兩個行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測定的檢出值分別為6.58、7.03和6.46 μg/L，變異系數(shù)小于4.5%； 而本方法卻極大地節(jié)省了檢測時間， 有機溶劑使用較少， 說明本方法簡單快速、靈敏、可靠。

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動物尿液中11種β.受體激動劑的檢測 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法. 農(nóng)業(yè)部1063號公告.3.2008， 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

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篇9

關(guān)鍵詞：苯唑西林鈉；反相高效液相色譜法；物質(zhì)；測定；檢測

苯唑西林鈉是青霉素抗生素類的一種常見藥物，不僅用于口服，目前很多臨床診療中都將這類藥物作為肌肉注射藥物，主要用于治療輕度感染方面。但如果采用靜脈注射還是靜脈滴注，那說明患者的感染比較嚴(yán)重，是用于葡萄球菌等抗生菌藥物的常見方式。近年來，隨著人們健康醫(yī)療醫(yī)師的不斷提升，對于各類藥物的使用安全提出了新要求，由此做好這些藥物相關(guān)物質(zhì)檢定工作不容忽視，也是臨床診療工作重點所在。下面我們就反相高效液相色譜法在苯唑西林鈉中的具體檢測應(yīng)用情況作了深入分析。

1 儀器與藥物的選擇

1.1 儀器選擇

在本次試驗中所選擇的高效液相色譜儀主要是以美國某公司生產(chǎn)的，它包含了四元梯度泵、自動進樣器等。電子天平主要選擇了梅特勒240型號，其靈敏度最高達十萬分之一。

1.2 藥物的選擇

本次試驗中，苯唑西林鈉的選擇是嚴(yán)格按照其藥物性質(zhì)開展的，這類藥物作為耐酸耐酶的半合成青霉素藥物，具體療效與青霉素相差無幾，屬于細菌細胞蛋白結(jié)合藥物，主要在于影響細胞細胞壁的合成，從而達到殺菌、消毒、消炎的作用。目前，我國國內(nèi)生產(chǎn)的苯唑西林鈉普遍都為無菌分裝、無輔料的方式。但是時至今日，國內(nèi)對這些藥物的檢定標(biāo)準(zhǔn)并不都，各種鑒定結(jié)果還并不是很完善。在本次試驗中我們選擇的苯唑西林鈉為注射用藥，藥物規(guī)格為：0.5g?瓶-1，乙腈和醋酸銨都滿足國家生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)和用藥標(biāo)準(zhǔn)。水主要為純凈水（即蒸餾水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件的預(yù)備工作主要包含了對色譜柱、醋酸銨溶液、流動相等準(zhǔn)備工作的開展。色譜柱主要為C18，其內(nèi)部物質(zhì)為250mm×46mm.醋酸銨溶液在配備的時候酸堿值為5，與乙腈的比例為75：25；流動相為0.01mol?min-1。

2.2 檢測波長的選擇

此次實驗工作的目標(biāo)在于注射用苯唑西林鈉，因此在檢測的時候首先用電子天平城區(qū)一定量的苯唑西林鈉含量，并且用流動相溶解的方法將其制作成為含1mg?ml-1的苯唑西林鈉溶液，用二極管陣列檢測的方式對這些溶液中的含量進行檢測，通過掃描得出溶液匯總的波長為400～200nm。通過研究得出，這些波長在225nm的時候吸收能力最強，雜質(zhì)也比較少。因此在具體的研究中我們可以將225nm波長作為研究重點，具體如圖1所示。

2.3 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.3.1 溶液的制備。稱取注射用苯唑西林鈉25.16mg，置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度。

2.3.2 流動相pH值的確定。用醋酸和三乙胺調(diào)節(jié)不同pH值的流動相進行試驗，結(jié)果表明在pH值為5.0時，峰的對稱性最好。

2.3.3 緩沖鹽濃度的確定。配制不同濃度的醋酸銨溶液作為流動相水相進行試驗，結(jié)果表明在濃度為0.01mol?L-1時，雜質(zhì)的分離度與對稱性最好。

2.4 方法的專屬性考察

2.4.1 酸破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，加1mol?L-1鹽酸10mL溶解后，放置1h，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

2.4.2 堿破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，加0.05mol?L-1氫氧化鈉溶液2mL溶解后，放置3min，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

2.4.3 氧化破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，加3%過氧化氫2mL溶解后，放置2h，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

2.4.4 熱破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，70℃水浴中加熱2h，放冷至室溫。

2.4.5 光照破壞。稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，置于25mL量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，用3000～4000Lx光照射10d。具體結(jié)果間圖2所示。

2.5 線性關(guān)系

精密稱取注射用苯唑西林鈉58.57mg置50mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2.5mL置100mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、2、4、6、10、12和24mL各置25mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件分別精密量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以供試液濃度C（μg?mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，回歸方程為：A=5.238×104C+4.182×103，r=0.9998，表明苯唑西林鈉濃度在1.171～28.11μg?mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3 討論

中國藥典2010年版二部收載了本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有關(guān)物質(zhì)的檢驗方法和限度設(shè)定系完全參照BP2008制定，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，并采用相對保留時間對其中的特殊雜質(zhì)進行定位[雜質(zhì)B≤1.5%、雜質(zhì)D≤0.5%、雜質(zhì)E（即氯唑西林）≤1.0%、其他單個雜質(zhì)≤0.5%，總雜質(zhì)≤3.0%]。經(jīng)對該方法進行方法學(xué)考察，發(fā)現(xiàn)采用相對保留時間對特殊雜質(zhì)定位的誤差較大，且色譜系統(tǒng)的耐用性不好，部分色譜柱的分離度無法達到要求或完全無法分離。本文采用的HPLC色譜條件能將各雜質(zhì)進行有效分離，且實驗中選擇醋酸銨溶液作為流動相的水相，便于將質(zhì)譜儀串聯(lián)于PDA檢測器之后，流出液可直接進入質(zhì)譜儀，利于后續(xù)研究的進行。選擇醋酸銨溶液濃度為0.01mol?L-1，峰形對稱，柱效高，基線平穩(wěn)。

結(jié)束語

在酸、堿、氧化破壞試驗中表明，本品易受這些條件的影響，光照與溫度也易影響本品的質(zhì)量，故應(yīng)注意本品的儲藏條件和使用的期限。

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篇10

關(guān)鍵詞：1，4二氯苯；吹掃捕集；氣相色譜；毛細管柱；1，4二氯苯

中圖分類號：TG4 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-2374（2013）06-0050-02

1，4二氯苯廣泛用于工業(yè)用和家用產(chǎn)品，如氣味掩蓋劑、染料和殺蟲劑，有資料顯示DCB短期接觸后會對人體造成急性溶血性貧血、腎小球腎炎，長期接觸1，4二氯苯會引起網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)紊亂、中樞神經(jīng)受影響和肝損傷。1，4二氯苯是《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB5749-2006）要求檢測的有機物指標(biāo)，規(guī)定在飲用水中的含量不得超過0.3mg/L。GB5749-2006中采用填充柱進行分離，由于填充柱分離度、靈敏度不高，使用效率較低。吹掃捕集技術(shù)具有濃縮倍數(shù)高、可測定范圍寬、無溶劑污染等優(yōu)點，是測定水中揮發(fā)性有機物的有效方法，為此建立毛細管柱氣相色譜法測定水中1，4二氯苯，其分離度好，采用吹掃捕集進樣，預(yù)處理簡單快速，靈敏度高。

1 試驗儀器與試劑

1.1 試驗儀器

安捷倫7890氣相色譜儀，ECD檢測器，毛細管柱使用19091J-413毛細管柱（30m×0.32mm×0.25um），

色譜柱使用HP-5型；吹掃捕集進樣器使用美國

TELEDYNE TEKMAR（型號），5mL注射器。

1.2 試驗試劑

標(biāo)準(zhǔn)溶液：購自百靈威公司（J&K）1，4二氯苯濃度為100mg/L。

甲醇：色譜純。

純水：無揮發(fā)性有機物（VOCS）超純水。

2 試驗方法

2.1 樣品進樣處理

采用直接進樣方式，進樣時用5mL注射器于待測水樣中抽吸幾次，排出氣泡后迅速注入吹掃捕集進樣器中，按預(yù)先設(shè)置好的條件進行分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將濃度為100mg/L的1，4二氯苯標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配置成1mg/L的1，4二氯苯儲備溶液，然后用純水配置成100μg/L的1，4二氯苯標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，再取4個100mL的容量瓶，分別取1mL、2mL、5mL、10mL的100μg/L的1，4二氯苯標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用超純水配置成濃度為0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L、0.010mg/L的1，4二氯苯標(biāo)準(zhǔn)系列，按2.3的條件測定。

2.3 儀器條件

2.3.1 檢測器：以ECD為檢測器。

2.3.2 色譜條件：色譜柱采用非極性常用柱19091J-413；升溫程序：40℃保持1min，以5℃每分鐘速率升至80℃，以10℃每分鐘速率升至150℃保持1min。

進樣方式：分流進樣，分流比5：1；進樣口溫度：210℃；檢測器溫度：250℃；載氣流量（高純氮）：柱流速1.5mL/min。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

1，4二氯苯濃度作為X軸，峰面積為Y軸，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=725.19X+86.20，相關(guān)系數(shù)R=0.9995。1，4二氯苯標(biāo)準(zhǔn)曲線中各濃度測定的響應(yīng)值（峰面積）見表1，1，4二氯苯標(biāo)準(zhǔn)色譜見圖2。

由表3可知，該實驗加標(biāo)回收率良好，加標(biāo)回收率在97.33%～98.87%之間，平均回收率為98.26%，符合75%～105%范圍。

4 結(jié)語

采用吹掃捕集毛細管柱氣相色譜法測定水中的1，4二氯苯，操作簡便，測定結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。該方法實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)R=0.9995，線性良好；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.70%，小于5%；加標(biāo)回收率在97.33%～98.87%之間，平均回收率為98.26%，符合75%～105%范圍，精密度和加標(biāo)回收率良好，對于檢測自來水和地表水中的1，4二氯苯具有很好的實用價值。

參考文獻

[1] 世界衛(wèi)生組織.飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則[S]：369-371.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006）[S].

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法有機物指標(biāo)（GB/T5750.8-2006） [S].